在 3D 细胞培养技术飞速发展的今天，类器官凭借其模拟体内器官结构与功能的优势，成为研究发育、疾病机制及药物筛选的核心模型。

然而，类器官的三维结构也为观测带来挑战 —— 传统切片成像破坏样本完整性，常规显微镜难以穿透厚样本。

“类器官 + 组织透明化 + 光片显微镜” 的技术组合，恰好破解了这一难题。本文结合三篇核心文献，从文献简介、组织透明化方法、光片成像方案、分析结果四个维度，详细拆解这项技术的落地应用，为科研人员提供实用参考。

肿瘤类器官药物筛选 —— 单细胞水平解析药物疗效差异

01文献简介

发表于《BMC Cancer》（2024）的《A spheroid whole mount drug testing pipeline with machine-learning based image analysis identifies cell-type specific differences in drug efficacy on a single-cell level》，聚焦肿瘤微环境中 “肿瘤细胞 - 成纤维细胞” 相互作用对药物响应的影响。研究团队构建了 KP-4 胰腺癌细胞与 CCD-1137Sk 成纤维细胞的共培养类器官模型，开发了一套从类器官制备、透明化、3D 成像到深度学习分析的完整流程，在单细胞水平揭示了不同细胞类型对药物的差异性响应。

02组织透明化方法

该研究针对肿瘤类器官（直径可达 500μm）的厚样本特性，采用甘油基光学透明化技术，具体步骤如下：

1.样本预处理：类器官经 4% 多聚甲醛（PFA）固定 1 小时后，用含 1% 胎牛血清（FBS）的 PBS 清洗，再用 0.5M 淬灭残留固定剂，避免荧光信号干扰。

2.渗透增强：将类器官置于含 0.2% Triton X-100、0.3M 、20% DMSO 的穿透缓冲液中孵育 30 分钟，为后续抗体渗透和透明化试剂扩散铺路。

3.透明化处理：可平衡类器官内部与外部环境的折射率，显著降低光散射，确保激光能穿透 500μm 厚的类器官，同时避免样本收缩或变形。

4.验证环节：通过对比 “透明化类器官的光学切片” 与 “传统冷冻切片” 的荧光信号（Ki-67 增殖标记、Cleaved Caspase-3 凋亡标记），证明透明化后不同深度（50μm、250μm、500μm）的细胞标记率与冷冻切片无显著差异，验证了透明化的可靠性。

03成像方法

样本挂载：透明化后的类器官置于含 88% 甘油的 Ibidi μ-slide 中，平衡温度后成像，避免样本移动或脱水。

成像参数：采用 20× 水浸物镜（NA 0.75），激光波长覆盖 405nm（DRAQ5 核染）、488nm（荧光抗体）、561nm（坏死标记），z 轴步长 1μm，激光强度控制在 1-2% 以减少光毒性，同时开启 z 补偿功能，抵消深度依赖的信号衰减。

数据兼容性：也可适配光片显微镜的多视角成像需求 —— 若改用光片显微镜，仅需调整样本挂载方式（如 FEP 管固定），即可实现更快的成像速度。

04分析结果

类器官生长与药物响应特征：

共培养类器官（KP-4+CCD-1137Sk）比 KP-4 单培养类器官生长更快，处理后，总细胞数仍高于单培养组，初看似乎 “共培养增强耐药性”。

但单细胞水平分析揭示：成纤维细胞是耐药核心——CCD-1137Sk 成纤维细胞对两种药物的耐受性显著高于 KP-4 肿瘤细胞，说明共培养未增强肿瘤细胞耐药性，反而可能通过旁分泌信号增加其敏感性。

空间分布特征：

通过 3D 壳层分析（将类器官分为内、中、外三层），发现未处理组中 90% 的增殖细胞（Ki-67+）位于中外层，50-60% 的凋亡细胞位于核心；药物处理后，共培养类器官核心区域的增殖细胞减少更显著，而单培养类器官的凋亡细胞主要集中在外层，提示微环境影响药物在类器官内的渗透与作用。

乳腺类器官动态观测 —— 

光片显微镜追踪发育与信号变化

01文献简介

发表于《Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia》（2025）的《Live-cell imaging of mammary organoids using light sheet microscopy》，针对乳腺类器官的动态发育研究需求，优化了 “类器官培养 - 透明化 - 光片成像” 的全流程。研究以小鼠乳腺类器官（含 EKAREV-NLS 荧光报告基因或 H2B-mCherry 核标记）为模型，开发了多视角和倒置两种光片显微镜的样本挂载方案，实现长达 72 小时的低光毒性实时成像，清晰捕捉乳腺类器官分支形态发生、细胞增殖及信号分子动态变化，为乳腺发育生物学提供了全新观测工具。

02组织透明化方法

考虑到乳腺类器官（部分为囊性结构）的脆弱性，研究采用温和透明化策略，避免破坏样本完整性：

1.类器官包埋：若需长期存储或高分辨率成像，采用Matrigel / 胶原 I 基质保留策略—— 类器官嵌入含 15mg/mL 基底膜提取物（BME）和 1.5mg/mL 胶原 I 的 3D 基质。

2.类器官组织透明化：仅用少量 88% 甘油浸润，既维持基质结构，又轻度降低光散射，透明化后样本可在 4℃存储 1 周，-20℃存储 6 个月。

3.关键验证：对比 “无透明化活细胞成像” 与 “透明化固定成像” 的 Ki-67 标记率，两者无显著差异（活细胞组 54.37±1.68% vs 透明化组 47.44±1.98%），证明透明化不影响细胞状态评估。

03光片显微镜成像方法

研究核心采用多视角光片显微镜（ZEISS Lightsheet 7）和倒置光片显微镜（Luxendo TruLive3D），针对不同乳腺类器官类型设计专属方案：

1. 多视角光片显微镜（适用于大体积乳腺类器官，直径 > 300μm）

样本挂载：类器官嵌入 FEP 管（内径 1.3mm，壁厚 0.15mm）中的 ECM 凝胶柱，垂直悬挂。

成像参数：采用 10× 和 20× 检测物镜，光片厚度 6μm，多视角（4 个角度）成像后拼接，z 轴步长 2μm。 

优势：可捕捉类器官 360° 全景，解决大体积样本的 “盲区” 问题。

2. 倒置光片显微镜

样本挂载：类器官置于 V 型 FEP 孔中，底部铺薄层高浓度 ECM 凝胶（5μL Matrigel）。

成像参数：采用 20× 水浸物镜，双光片照明，z 轴步长 1μm。

04分析结果

乳腺类器官发育动态：

单细 - 胞来源的乳腺类器官（H2B-mCherry 核标记），光片成像清晰记录分支延伸速度（平均 2.5μm/h）和方向，发现分支优先向 ECM 凝胶疏松区域生长，提示基质硬度影响发育方向。

药物 / 因子处理响应：

加入 2.5nM FGF2 后，乳腺类器官分支数量在 6 天内增加 3 倍，光片成像追踪到 FGF2 诱导的 “顶端细胞增殖 - 基底细胞迁移” 协同过程；而加入 ERK 抑制剂后，分支延伸停滞，且顶端细胞 ERK 活性降至基线水平，验证了 ERK 信号的关键作用。

成像质量与光毒性：

连续 72 小时成像后，乳腺类器官的存活率仍保持 80% 以上（Live-or-Dye 坏死标记率 < 5%），远高于共聚焦显微镜（48 小时存活率 < 50%），证明光片显微镜的低光毒性优势；且成像分辨率足以区分单个细胞的核形态（如成纤维细胞的细长核 vs 上皮细胞的圆形核）。

多类型类器官通用成像 —— 

果糖 - 甘油透明化与光片技术的普适方案

01文献简介

发表于《Nature Protocols》（2019）的《High-resolution 3D imaging of fixed and cleared organoids》，提出了一套适用于人肠道、肝脏、乳腺、气道、肾脏类器官的通用 3D 成像 protocol。研究团队研发了低毒性、高透明效果的 “果糖 - 甘油透明化试剂”，结合共聚焦、多光子和光片显微镜，实现从细胞骨架到亚细胞结构的高分辨率成像，且透明化样本可长期存储，为不同来源类器官的标准化成像提供了 “操作手册” 级方案，已被广泛应用于疾病建模和药物筛选研究。

02组织透明化方法

该研究的核心创新是果糖 - 甘油（FG）透明化试剂，具体配方与流程具有普适性：

1.透明化流程：

PFA固定：类器官经 4% PFA 固定 45 分钟（囊性类器官可缩短至 30 分钟，避免塌陷），用含 0.1% Tween 20 的 PBS（PBT）清洗 3 次。

免疫标记：（一抗 4℃孵育过夜，二抗 4℃孵育过夜），用器官清洗缓冲液（OWB：含 1% BSA、0.1% Triton X-100 的 PBS）充分清洗，去除未结合抗体。

透明化处理，室温孵育 20 分钟，即可成像；若需存储，可直接置于 - 20℃，6 个月内荧光信号无显著衰减。

2.优势对比：

类器官透明化后的 DAPI 荧光强度高 3 倍，且透明化后类器官无收缩。

与无透明化相比：可使成像深度提升 2 倍（无透明化仅能穿透 100μm vs 透明化可穿透 200-500μm），且深层细胞的信号强度衰减率降低 50%。

03光片显微镜成像方法

研究针对不同类器官特性，适配光片显微镜（Zeiss Light Sheet Z.1） 的标准化方案：

样本挂载（光片专用）：

类器官与低熔点琼脂糖（0.4%）+ FG 试剂混合（40℃下制备），吸入玻璃毛细管（直径 1.5mm），4℃冷却凝固后，将毛细管置于光片成像 chamber 中，chamber 内填充 FG 试剂，避免样本脱水。

成像参数：

 10×（NA 0.2）和检测物镜 20×（NA 1.0，适配 透明化试剂的折射率），光片厚度 6μm，双光片照明以减少阴影，z 轴步长 1-2μm，根据类器官大小调整成像范围（肠道类器官需 z 范围 500μm，气道类器官需 300μm）。

多模态兼容：

若类器官含荧光报告基因（如 H2B-mNeonGreen），可直接成像；若需免疫标记，可在透明化前完成，透明化过程不影响抗体结合效率（如 E - 钙粘蛋白标记率与未透明化组一致，均为 95% 以上）。

04分析结果

| 三维可视化：组织透明化后类器官三维成像相较于二维成像的优势，能够清晰呈现类器官样本的关键结构特征。

| 成像深度与荧光强度加深：透明化步骤后，与未进行透明化处理的样本相比，类器官成像的荧光强度显著增强，且 z 轴方向的成像穿透深度也有所提升。

| 3D细胞亚型定量分析：能够支持细胞分割算法对整个类器官中细胞的数量以及不同细胞亚型中各类细胞标志物的存在情况进行定量分析

类器官组织透明化解决方案

01组织透明化的高深度、高质量，高通量类器官平台

快速透明化—仅需5-10min即可透明化500um 厚的样品

温和光学透明化—对荧光标记组织进行透明化用于 3D 成像后，对检测灵敏度或样品形态的影响小

工作流程兼容性—无需其他设备或仪器即可轻松实现

平台兼容性—与大多数荧光染料和标准荧光成像仪器兼容

光片显微平台—实现高分辨类器官三维可视化

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