荧光定量PCR（qPCR）虽为核酸定量的金标准，但因操作步骤多、影响因素复杂（如RNA质量、引物设计、仪器性能等），易导致实验室间数据差异。为此，国际上提出了MIQE指南（Minimum Information for Publication of Quantitative Real-Time PCR Experiments），作为标准化流程的依据，旨在提升数据透明度与可信度。以下是标准化流程的详细解析：

数据标准化流程（以ΔΔCt法为例）：

1、?计算ΔCt值?

公式：ΔCt = Ct（目标基因） - Ct（内参基因）?。

每个样本需至少3次技术重复，取平均值以减少误差。

2、?计算ΔΔCt值

公式：ΔΔCt = ΔCt（实验组） - ΔCt（对照组）?。

对照组通常为未处理组或基线样本。

3、?相对表达量计算

公式：相对表达量 = 2^{-\Delta\Delta Ct}2 ?ΔΔCt。

结果以“对照组表达量为1”为基准，实验组显示倍数变化。

质量控制与注意事项：

1、?实验设计

设置无模板对照（NTC）和阳性对照，排除污染或扩增异常。

模板稀释后以大体积加入反应体系，减少加样误差。

2、?数据分析

剔除异常值：如Ct值＞35或溶解曲线异常（多峰）的样本。

扩增效率验证：标准曲线R2＞0.98，斜率-3.3±0.1。

3、?报告规范

需标注内参基因名称、ΔΔCt计算方法和生物学重复数。

内参基因选择：

选择一个或多个稳定的内参基因作为标准化的依据。这些基因在实验条件下表达稳定，不受到实验处理的影响。常见的内参基因包括GAPDH、β-actin、RPL13A等。

目的基因与内参基因Ct值的确定

通过qPCR实验，分别测定目的基因和内参基因在每个样本中的Ct值。

常用的qPCR数据分析软件包括：

1、Bio-Rad CFX Maestro

2、GraphPad Prism

3、R语言中的qPCR包

建议

要实现真正的数据标准化，必须：

遵循MIQE指南报告所有必要信息；

每个样品进行技术重复（至少3复孔）；

记录完整的实验参数（仪器型号、试剂批号、程序设置等）；

使用相同的数据分析方法和软件版本。?