遇到ELISA实验失败别灰心，重新开始的关键是?系统性排查、优化操作、强化质控?。

一、实验前准备与评估

1、回顾与记录?：复盘失败原因（如高背景、信号弱），记录试剂批号、样本信息。

2、试剂与材料检查?：

确认试剂在有效期内，按说明书要求保存（避光、低温）。

严禁混用不同批号或厂家的试剂?。

检查耗材（吸头、酶标板）无破损，使用低吸附耗材。

3、样本预处理?：

离心?：血清/血浆样本4℃、2000-3000g离心10-15分钟，去除碎片。

分装?：按一次用量分装，避免反复冻融。

稀释?：通过预实验确定稀释比例（如5-10倍梯度稀释），使样本OD值落在标准曲线线性范围内。

二、优化实验操作流程

1、标准曲线制备?：

复溶?：用试剂盒提供的稀释液重溶冻干标准品，短暂离心后混匀。

梯度稀释?：采用反向稀释法或倍比稀释法，配制浓度梯度，覆盖样本预期浓度范围。

加样?：标准品和样品需在同一块酶标板上同步检测，使用校准移液器，垂直加样至孔底，避免触碰孔壁或产生气泡。

2、加样与孵育?：

加样?：建议从低浓度（标准品）到高浓度（样本）加样，减少“跳孔”误差。

孵育?：严格控制温度（通常37℃）和时间，使用恒温设备避免波动，覆盖封板膜防止蒸发。

3、洗涤步骤?：

洗涤液?：使用含0.05%-0.1% Tween 20的PBS缓冲液。

操作?：每孔加满洗液，浸泡30秒至1分钟后吸弃，重复洗涤3-5次，避免过度洗涤。

4、显色与终止?：

显色?：避光显色，根据阳性孔与阴性孔颜色对比度判断终止时机（如TMB显色15-30分钟）。

终止?：加入终止液（如TMB用硫酸），立即读数。

三、数据读取与分析

1、仪器设置?：

酶标仪预热?：开机预热15分钟。

波长选择?：设置主波长（如TMB为450nm）和参考波长（如630nm）。

调零?：使用空白孔（仅含缓冲液）调零。

2、数据计算?：

扣除背景?：样本OD值减去空白孔平均OD值。

标准曲线拟合?：使用四参数逻辑回归（4-PL）等软件拟合标准曲线，要求R2≥0.99。

计算浓度?：将样本OD值代入标准曲线方程，计算浓度并乘以稀释倍数。

四、质量控制与验证

1、对照设置?：

空白孔?：仅含显色液，OD值应（通常<0.1）。

阴性对照?：OD值应显著低于阳性对照（P/N比值≥2）。

阳性对照?：OD值应明显高于Cut-off值，证明试剂活性正常。

2、重复性验证?：

复孔检测?：每个样本设置2-3个复孔，计算平均OD值，单个OD值与均值偏差应≤20%。

批内/批间精密度?：计算变异系数（CV值），应≤15%。

3、回收率实验?：在样本中添加已知浓度标准品，回收率应在80%-120%范围内，验证方法准确性。

五、常见问题预防与快速应对

高背景?：优化封闭条件（如增加BSA浓度至1%）、增加洗涤次数（5-8次）、更换封闭剂。

信号弱?：优化抗体浓度（进行棋盘滴定）、延长孵育时间、确保底物新鲜且避光使用。

重复性差?：使用校准移液器和多通道加样器、确保恒温孵育、检查洗板机管路是否通畅。

边缘效应?：使用封板膜密封反应板，避免将多块板叠加放置在孵育箱中，确保孵育箱温度稳定且分布均匀。

六、寻求技术支持

若按上述流程操作后问题仍存在，联系试剂盒技术支持，提供：

完整实验数据（标准曲线图、所有OD值）。

试剂盒批号和有效期。

问题详细描述（如异常现象、已尝试操作）。

关键预防措施?：

1、试剂管理?：严格按说明书保存（避光、低温），避免混用不同批号试剂；开封后分装使用。

2、操作规范?：使用带滤芯吸头防止交叉污染；加样垂直、缓慢；洗板后拍干。

3、环境控制?：保持实验室温湿度稳定（建议25℃，湿度<60%），避免震动或强光直射。

4、定期维护?：每月校准移液器、酶标仪；清洗洗板机管路，确保无堵塞。

建立并严格执行标准化操作流程（SOP），是获得可靠、可重复结果的根本保障。